表面增強拉曼散射(SERS)光譜可將材料表面吸附分子的拉曼訊號增強106~1014倍，具有成為單分子生化感測器的潛力。本文除了介紹SERS 在各領域的一些應用外，也從歷史的角度回顧SERS光譜的發展，並解釋其訊號增強機制。文中我們也討論SERS技術的優勢與挑戰，其中邁向商品化最大的挑戰為穩定SERS基板的製作流程。最後並簡介工研院材化所SERS技術的發展現況。
拉曼光譜的發展
早在1928 年，印度物理學家拉曼發現了獨特的散射光譜，此光譜可與分子結構相對應，此一科學上的重要突破並讓其獲得1930 年的諾貝爾物理學獎。但因為拉曼散射訊號太微弱，因此直到1960 年雷射的發明，提供高強度的單頻光源，才真正使得拉曼光譜成為研究分子結構的重要工具。拉曼光譜和紅外光譜一樣同屬於分子振動光譜，其光譜具有像指紋一樣的專一性，可以反映分子結構的特徵。
然而一般非共振形式的拉曼散射效應是個非常微弱的過程，一般約106~108個入射光光子才發生一次非彈性碰撞的拉曼散射。這種本質上的微弱訊號使拉曼光譜在對敏感度要求較高的應用中受到了許多限制。因此為了使拉曼光譜發揮其強大的功能，科學家們努力研究各種可以幫助提升拉曼訊號的方式，例如共振拉曼效應(Resonance Raman; RR)，意即當入射光的波長處於所量測分子的電子吸收峰範圍內時，電子發生躍遷的機率會大大提升，使某些分子振動模式的拉曼散射截面積(Scattering Cross Section)可增強高達106倍，使得檢測單層(Monolayer)分子成為可能。然而共振拉曼效應不是“表面”專一的效應，待測溶液中其他物種若也處於此電子吸收峰範圍內時，其訊號會相互干擾，造成判讀上的不易。此外只有特定分子會在可見光區有相匹配的電子吸收能階，也限制了可量測物種的範圍。
表面增強拉曼光譜的發現
1974 年， Fleischmann 等人經過粗糙化的銀電極表面後，首次獲得吸附在銀電極表面單分子層砒啶(Pyridine)的拉曼光譜。自此開啟了表面增強拉曼散射光譜(Surface Enhanced Raman Scattering; SERS)的首頁。隨後許多團隊的研究發現，拉曼訊號增強不只是因為粗糙結構使表面積增加，還包含因為貴重金屬（如金、銀）材質的奈米結構，使拉曼散射訊號有顯著的增強（1014倍）。1997 年Kneipp 、Nie 等研究團隊更首次驗證SERS 技術具有偵測單分子的能力。科學家們除了研究如何設計合適的奈米結構以增強拉曼訊號，也追求更高的空間解析度，以提供更豐富的資訊。2000 年利用所謂的針尖增強拉曼光譜技術(Tip Enhanced Raman spectroscopy; TERS)量測BCB (BrilliantCresyl Blue)分子的拉曼影像也首度被驗證，其後更用在許多領域的研究上，如DNA 、奈米碳管等。回顧1974 年發現SERS 現象至今，從SCI 資料庫中每年相關主題的學術論文數統計表（見圖一）可看出，這個研究領域在近年來有快速發展且持續成長的趨勢，圖中並標出了幾個重要的里程碑。
圖一、SERS 的發展趨勢
SERS 的優勢與挑戰
表面增強拉曼散射(SERS)光譜相較於傳統拉曼光譜具有微量量測及表面專一的特性。相對於其他光譜技術，如紅外吸收光譜，則具有互補的特性。通常紅外吸收光譜弱的分子其拉曼訊號會較強，因此兩種光譜可以互補不足。此外因為水分子的拉曼訊號極微弱，不會干擾待測物的拉曼訊號，所以SERS 光譜也很適合量測水溶液中的生物分子。又SERS 光譜只對金屬表面附近數奈米距離內的分子敏感，因此適合做為研究表面科學的工具。
當吸附在金屬表層的分子發生微小方位改變時，會反應在拉曼光譜上，可做為線上監控某些化學反應的工具。然而SERS 的優勢有時也會變成自身所面臨的挑戰，由於分子吸附在金屬表面的狀態是影響SERS 效應是否會發生與訊號強弱的因素，因此如何使待測分子能穩定吸附是個難題。另外並非所有分子都有很強的拉曼散射強度，大部分的生物樣品的拉曼訊號均很微弱，因而需要有更高增強因子的基板設計。而複雜的生物體或混合物中的拉曼訊號解析也是一大難題，通常得通過一些樣品前處理或標定的動作。由於SERS 的電磁場增強效應和表面電漿的產生有關，如何穩定調控金屬奈米結構的尺寸、形狀、排列以獲得靈敏度高、穩定性高、可重複使用的基板，是邁向商品化的最終挑戰。
工研院材化所SERS 技術發展現況
為了提供穩定、再現性高、可搭配奈米壓印量產製程的SERS 基板，我們採用具有覆金屬膜的奈米壓印週期性結構。首先測試金屬鍍膜對於增強拉曼訊號的影響，我們比較了單純只有奈米結構薄膜以及鍍了金屬膜的奈米結構兩種狀況。在相同實驗條件下，量測10-3M的R6G 溶液。由圖二可知，單純只有奈米結構薄膜是量不到任何拉曼訊號的（即使積分時間變為10 倍也無任何訊號），反之鍍上金屬膜後的奈米結構，因為可以激發表面電漿造成局部電場的增強而有明顯的SERS 效果。此外，若所量測分子有螢光反應（如R6G 分子），則此螢光背景訊號會干擾整體訊號強度，造成拉曼訊號強度判讀不易。
圖二、比較奈米結構薄膜上有無鍍金屬膜所造成拉曼訊號的差異
由於螢光具有隨時間衰減的特性，可用雷射照射一段時間使螢光背景下降，並透過扣除背景訊號的方式，得到較純粹的拉曼光譜。如圖三所示，在不同時間點量測同一位置，螢光背景強度會下降，但扣除背景訊號的拉曼訊號呈現穩定狀態(時間變異度<5%)。由於我們採用的SERS 基板是週期性結構，因此在同一片試片上不同位置所量測到的拉曼訊號也有相當不錯的區域穩定性。
圖三、同一位置不同時間點量測的拉曼訊號
有了系統時間穩定性及區域穩定性的驗證，我們可進一步測試SERS 基板對不同濃度分子的反應曲線。首先準備幾種不同濃度範圍(10-5~10-8M)的孔雀綠溶液，拉曼訊號在10-6~10-8M的濃度區間具有線性變化的區域，可定量量測濃度。而到了10-5M時，由於待測分子已經鋪滿了整個金屬表層，而表面增強拉曼訊號又只和表層的分子有關，因此訊號達到一個飽和的狀態。此外在相同實驗條件下，量測10-8M 的MG溶液，我們所設計的電漿子共振SERS基板與市售的基板(Klarite Substrate from D3 Technologies Ltd.)相比較，拉曼訊號大約強10倍，已達到商用產品規格的水準（圖六）。總合而言，我們利用週期性奈米結構基板鍍上特定厚度的金屬膜，調控表面電漿子共振發生的波長與入射光波長一致，做為表面增強拉曼散射的基板已成功的量測到10-8 M 濃度的孔雀綠分子的拉曼訊號。此外，對於濃度介於10-6~10-8M 的孔雀綠溶液，有一段線性變化的區域可定量此分子的濃度。目前所設計的SERS 基板以10 秒的積分時間可測量到10-8 M（約3.65ppb）孔雀綠(MG)溶液的拉曼訊號，非常適合做為快速檢測的生化微量感測器的應用。
圖六、與商用SERS 基板比較
SERS 的產業應用
SERS 技術近年來廣泛地被應用在各種領域，以下僅列舉一些正在發展的方向提供有興趣的人士參考。包括生物學(Biology)，例如細菌分類、蛋白質研究及腫瘤細胞辨識等；醫學製藥(Medicine)，例如免疫檢測、細胞研究；材料科學(Material Science)，例如奈米碳管、聚合物、自我組裝分子層的研究；電化學(Electrochemistry)，例如檢測某化學物質在氧化還原反應中量值的變化；環境監控(Environment)，例如水污染監控、殘留毒化物檢測；國家安全(National Security)，例如微量炸藥檢測、毒氣檢測；健康監控(Healthy)，例如血糖、膽固醇偵測等。
SERS 技術近10 年來因為雷射技術、拉曼光譜儀器及奈米製程技術的成熟而獲得快速的發展，也驗證具有廣泛應用在各個領域的潛力。但由於SERS 牽涉到了光－分子－奈米結構三者的交互作用，因此需要不同專業間的整合才有機會對於複雜的拉曼散射增強機制提出完整的解釋，因此理論的發展是未來SERS 技術發展的重點之一。在應用方面，如何大量生產高再現性、高穩定度，高靈敏度且可重複使用的奈米結構基板，也將是科學家們所努力追求的。
對於表面增強拉曼散射光譜的發展與應用有興趣者，歡迎mail至materialsnet@itri.org.tw
作者： 林鼎晸、朱仁佑、張祐嘉、汪天仁、蔡枝松、葉吉田、王俊凱/工研院材化所
★本文節錄自「工業材料雜誌261期」，更多資料請見：https://www.materialsnet.com.tw/DocView.aspx?id=7176